下面介绍一个用于 RNA 干扰的 AAV 设计实验方案。首先要从以下几个方面思考这样的载体设计有哪些注意点：
载体设计的一般考虑
插入基因的大小
miRNA 比常规的 cDNA 短很多，所以可能要考虑填充一些序列以便于 AAV 的正常包装。
启动子筛选
- pol III 可用作 miRNA 的初筛，因为它可以使得 miRNA 有一个较高的表达
- 出于安全性和组织表达有效性的考虑，需要选择 pol II 的其他一些启动子，如下(以下只是举个例子，其他启动子自行探索），表 1 是常见的启动子，表 2 是一些组织特异性启动子
| 名称 | 类型 | 5'-3' |
|---|---|---|
| H1 | Pol III | GGAATTCGAACGCTGACGTCATCAACCCGCTCCAAGGAATCGCGGGCCCAGTGTCACTAGGCGGGAACACCCAGCGCGCGTGCGCCCTGGCAGGAAGATGGCTGTGAGGGACAGGGGAGTGGCGCCCTGCAATATTTGCATGTCGCTATGTGTTCTGGGAAATCACCATAAACGTGAAATGTCTTTGGATTTGGGAATCTTATAAGTTCTGTATGAGACCACTCTTTCCC |
| U6 | Pol III | GAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACC |
| CB full length(CB) | Pol II | GATCTTCAATATTGGCCATTAGCCATATTATTCATTGGTTATATAGCATAAATCAATATTGGCTATTGGCCATTGCATACGTTGTATCTATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAATATGACCGCCATGTTGGCATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGACGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTCGATATCA |
| CB hybrid(CBh) | Pol II | AGATGTACTGCCAAGTAGGAAAGTCCCGTAAGGTCATGTACTGGGCATAATGCCAGGCGGGCCATTTACCGTCATTGACGTCAATAGGGGGCGTACTTGGCATATGATACACTTGATGTACTGCCAAGTGGGCAGTTTACCGTAAATACTCCACCCATTGACGTCAATGGAAAGTCCCTATTGGCGTTACTATGGGAACATACGTCATTATTGACGTCAATGGGCGGGGGTCGTTGGGCGGTCAGCCAGGCGGGCCATTTACCGTAAGTTATGTAACGCGGAACTCCATATATGGGCTATGAACTAATGACCCCGTAATTGATTACTATTAACCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGGAGTCGCTGCGTTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTAAGAGGTAAGGGTTTAAGGGATGGTTGGTTGGTGGGGTATTAATGTTTAATTACCTGTTTTACAGGCCTGAAATCACTTGGTTTTAGGTTGG |
| small CBA(smCBA) | Pol II | AATTCGGTACCCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGACGCTGCCTTCGCCCCG TGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAG |
表一
| 名称 | 5'-3' |
|---|---|
| Thyroxine binding globulin (TBG) promoter(liverspecific） | TGCATGTATAATTTCTACAGAACCTATTAGAAAGGATCACCCAGCCTC TGCTTTTGTACAACTTTCCCTTAAAAAACTGCCAATTCCACTGCTG TTTGGCCCAATAGTGAGAACTTTTTCCTGCTGCCTCTTGGTGC TTTTGCCTATGGCCCCTATTCTGCCTGCTGAAGACACTC TTGCCAGCATGGACTTAAACCCCTCCAGCTCTGACAATCCTCTTTC TCTTTTGTTTTACATGAAGGGTCTGGCAGCCAAAGCAATCAC TCAAAGTTCAAACCTTATCATTTTTTGCTTTGTTCCTCTTGGCC TTGGTTTTGTACATCAGCTTTGAAAATACCATCCCAGGGTTAATGC TGGGGTTAATTTATAACTAAGAGTGCTCTAGTTTTGCAA TACAGGACATGCTATAA |
| Human Synapsin I (SYN) promoter (neuron-specific） | AGTGCAAGTGGGTTTTAGGACCAGGATGAGGCGGGGTGGGGGTGCC TACCTGACGACCGACCCCGACCCACTGGACAAGCACCCAACCCCC ATTCCCCAAATTGCGCATCCCCTATCAGAGAGGGGGAGGGGAAACA GGATGCGGCGAGGCGCGTGCGCACTGCCAGCTTCAGCACCGCG GACAGTGCCTTCGCCCCCGCCTGGCGGCGCGCGCCACCGCCGCC TCAGCACTGAAGGCGCGCTGACGTCACTCGCCGGTCCCCCGCA AACTCCCCTTCCCGGCCACCTTGGTCGCGTCCGCGCCGCCGCCG GCCCAGCCGGACCGCACCACGCGAGGCGCGAGATAGGGGGGCAC GGGCGCGACCATCTGCGCTGCGGCGCCGGCGACTCAGCGCTGCC TCAGTCTGCGGTGGGCAGCGGAGGAGTCGTGTCGTGCC TGAGAGCGCAG |
| Human Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) promoter (astrocyte-specific） | GAGCTCCCACCTCCCTCTCTGTGCTGGGACTCACAGAGGGAGACC TCAGGAGGCAGTCTGTCCATCACATGTCCAAATGCAGAGCATACCC TGGGCTGGGCGCAGTGGCGCACAACTGTAATTCCAGCACTTTGG GAGGCTGATGTGGAAGGATCACTTGAGCCCAGAAGTTCTAGACCA GCCTGGGCAACATGGCAAGACCCTATCTCTACAAAAAAAGTTAAAA AATCAGCCACGTGTGGTGACACACACCTGTAGTCCCAGCTATTCAG GAGGCTGAGGTGAGGGGATCACTTAAGGCTGGGAGGTTGAGGCTG CAGTGAGTCGTGGTTGCGCCACTGCACTCCAGCCTGGGCAACAG TGAGACCCTGTCTCAAAAGACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAG AACATATCCTGGTGTGGAGTAGGGGACGCTGCTCTGACAGAGGC TCGGGGGCCTGAGCTGGCTCTGTGAGCTGGGGAGGAGGCAGACA GCCAGGCCTTGTCTGCAAGCAGACCTGGCAGCATTGGGCTGGCC GCCCCCCAGGGCCTCCTCTTCATGCCCAGTGAATGACTCACCTTG GCACAGACACAATGTTCGGGGTGGGCACAGTGCCTGCTTCCCGCC GCACCCCAGCCCCCCTCAAATGCCTTCCGAGAAGCCCATTGAGCA GGGGGCTTGCATTGCACCCCAGCCTGACAGCCTGGCATCTTGGGA TAAAAGCAGCACAGCCCCCTAGGGGCTGCCCTTGCTGTGTGGCGC CACCGGCGGTGGAGAACAAGGCTCTATTCAGCCTGTGCCCAGG AAAGGGGATCAGGGGATGCCCAGGCATGGACAGTGGGTGGCAG GGGGGGAGAGGAGGGCTGTCTGCTTCCCAGAAGTCCAAGGACA CAAATGGGTGAGGGGACTGGGCAGGGTTCTGACCCTGTGGGACCA GAGTGGAGGGCGTAGATGGACCTGAAGTCTCCAGGGACAACA GGGCCCAGGTCTCAGGCTCCTAGTTGGGCCCAGTGGCTCCAGCGTTTCCAAACCCATCCATCCCCAGAGGTTCTTCCCATCTCTCCAGGCTGATGTGTGGGAACTCGAGGAAATAAATCTCCAGTGGGAGACGG AGGGGTGGCCAGGGAAACGGGGCGCTGCAGGAATAAAGACGAGC CAGCACAGCCAGCTCATGTGTAACGGCTTTGTGGAGCTG TCAAGGCCTGGTCTCTGGGAGAGAGGCACAGGGAGGCCAGACAAG GAAGGGGTGACCTGGAGGGACAGATCCAGGGGCTAAAGTCCTGA TAAGGCAAGAGAGTGCCGGCCCCCTCTTGCCCTATCAGGACC TCCACTGCCACATAGAGGCCATGATTGACCCTTAGACAAAGGGC TGGTGTCCAATCCCAGCCCCCAGCCCCAGAACTCCAGGGAATGAA TGGGCAGAGAGCAGGAATGTGGGACATCTGTGTTCAAGGGAAGGA CTCCAGGAGTCTGCTGGGAATGAGGCCTAGTAGGAAATGAGG TGGCCCTTGAGGGTACAGAACAGGTTCATTCTTCGCCAAA TTCCCAGCACCTTGCAGGCACTTACAGCTGAGTGAGATAATGCC TGGGTTATGAAATCAAAAAGTTGGAAAGCAGGTCAGAGGTCATC TGGTACAGCCCTTCCTTCCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTGAGAC AAGGTCTCTCTCTGTTGCCCAGGCTGGAGTGGCGCAAACACAGC TCACTGCAGCCTCAACCTACTGGGCTCAAGCAATCCTCCAGCC TCAGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAAGCATGAGCCACCCCAC TCAGCCCTTTCCTTCCTTTTTAATTGATGCATAATAATTGTAAGTA TTCATCATGGTCCAACCAACCCTTTCTTGACCCACCTTCCTAGAG AGAGGGTCCTCTTGCTTCAGCGGTCAGGGCCCCAGACCCATGGTC TGGCTCCAGGTACCACCTGCCTCATGCAGGAGTTGGCGTGCCCAG GAAGCTCTGCCTCTGGGCACAGTGACCTCAGTGGGGTGAGGGGA GCTCTCCCCATAGCTGGGCTGCGGCCCAACCCCACCCCCTCAGGC TATGCCAGGGGGTGTTGCCAGGGGCACCCGGGCATCGCCAGTC TAGCCCACTCCTTCATAAAGCCCTCGCATCCCAGGAGCGAGC |
| Mouse Myelin Basic Protein (MBP) promoter (oligodendrocytespecific） | AAGCTTTGAGAGAAAAGGGACCAGATCTTATTCCTCACCGTGGC TTTAACACTTAGAGAAAATGCATCCCCTCTAATCAATAAGTCA TCGACAGTGGGTAGATGGAGGAACGGCAGTGCGTAGTAGGATGCG TGCTAAGCATAGTCTCGTGCATGGGTGCATAGATCGCTGGGCAGG TGGACAAGGTGGGGGTGGATAAAGAAGTGGGTAGATGATTGATG TTAGGTAAATATCACTGGGTGGACAGATGGGTGGTAGGTGGATGGA TGGTTAGAATAGTCAGAAGAGGGATGGATTGATAAGGTGAACAGA TGATAAATGGGTGATAGACTGGAAGGGTTGTCAAAAGAGGA TAAGGGAAGTGTGAGCTAGCCGTATTTCTAAGGTCAGTAATAGAG TTGGGAGAAGAGGTTAAGTTAC ATCCATTTAAACCTCACACGAAGCTGAGTGGGAATGGACTTGC TGCCGTTGGTGAGGAAAGCGTTGCATTTCCCGTGTGCTTGGTTG TGGAAGTGCTCAGGTCCCACATGAAGCAGTCAGGTTACTGCGGC TTACAGAGGAGCCAGATCCAAATGCCCCGAGTAAGCACG TCCCCGAGCCAGAGGCCTCCAGCGGAATCCGGGAGAGGGATTGC TCAGTGCCCTGCTTCCCTGGACTGTAAGCTGCAGAAAGATG TGGGAAGTCCTGTTCTCCACTGAGAACACTAAAAGCACCTTTTG TCAAACGACCGCTTCACATCTGGGGCTTGTGCACTGGTGGCC TTTTAAACCAGAGACAACCCACAAGATACCTAACCTGCGGGGCTC TCTGGTACAGTGAGCAACTCAGGAAATGCTTTGGCTTGATTGCTG TGGGCTCTCAGGCCATCGCCCTCTGGAGTGGTTCTTTTAATGAGAACCTGAAGATTGGCCCCTGAGCCATGTATACCAAGCAAGCTCAATCCAGGTTAGCTCCCTCTGGTTGGGGCAAGCTAACGTGCTC CTTGGGCCCCGCGCGTAACTGTGCGTTTTATAGGAGACAGCTAG TTCAAGACCCCAGGAAGAAAGCGGCTTTGTCCCCCTCTAGGCC TCGTACAGGCCCACATTCATATCTCATTGTTGTTGCAGGGGAGG CAGATGCGATCCAGAACAATGGGACCTCGGCTGAGGACACGGCGG TGACAGACTCCAAGCACACAGCAGACCCAAAGAATAACTGGCAA GGCGCCCACCCAGCTGACCCAGGGAACCGCCCCCACTTGA TCCGCCTCTTTTCCCGAGATGCCCCGGGAAGGGAGGACAACACC TTCAAAGACAGGCCCTCAGAGTCCGACGAGCTTCAGACCA TCCAAGAAGACCCCACAGCAGCTTCCGGAGGCCTGGATGTG |
| Human Rhodopsin kinase (GRK1) promoter (photoreceptorspecific | GGGCCCCAGAAGCCTGGTGGTTGTTTGTCCTTCTCAGGGGAAAAG TGAGGCGGCCCCTTGGAGGAAGGGGCCGGGCAGAATGATCTAA TCGGATTCCAAGCAGCTCAGGGGATTGTCTTTTTCTAGCACCTTC TTGCCACTCCTAAGCGTCCTCCGTGACCCCGGCTGGGATTTAGCC TGGTGCTGTGTCAGCCCCGGGCTCCCAGGGGCTTCCCAGTGG TCCCCAGGGAACCCTCGACAGGGCCAGGGCGTCTCTCTCG TCCAGCAAGGGCAGGGACGGGCCACAGGCAAGGGC |
表二
miRNA 骨架选择
miRNA 的骨架会影响其在细胞内的加工过程，从而影响它的实际作用。这里作者推荐 miR-155 的骨架，说是它在细胞内是比较有效的，对这一点感兴趣的看原文（请看文末）
miRNA 在 AAV 载体中的位置
- 最好避免将人工 miRNA 放置在离 ITR 很近的地方，因为这可能会干扰载体的产生
- In the context of a pol II promoter, previous work indicates that placing the miRNA either in the intron or in the 3'UTR is comparable
筛选 miRNA 需要考虑的地方
- 被敲减转录本容易被检测
- 目的细胞容易被感染
miRNA 设计
- 去 NCBI 找到目的基因的 mRNA 序列，怎么找可以参考我另一篇关于 CRSIPR-Cas9 的敲除步骤。
- http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi，在这个网站预测一下 RNA 结构，选择可接近位置的序列进行设计。
- 建议直接选择 10 条进行筛选，长度 22nt，位置 1 是 U，位置 2 是 A 或者 U，GC 含量约为 30- 60%，pol III 的启动子最好不要有连续 4 个 U。
- https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi，用这个网址看看你设计的序列有没有脱靶。
- 整体序列结构是：5 端骨架结构 +miRNA 的 guide strand+loop+miRNA passenger strand+3 端骨架结构
- 序列两端加上限制性酶切位点便与克隆。
文献看到这，反正我觉得我还不能设计 miRNA，所以这里就需要其他网站资料的帮助，比如可以看看专利什么的，https://patents.google.com/patent/CN107384957A/zh，
载体克隆
- 合成正反义链
- 通过在 8 μL 退火缓冲液中混合每种 1 μL 100 μM 的寡核苷酸（正向和反向）来退火寡核苷酸。加热至 95 ℃ 保持 5 分钟，然后缓慢冷却。
- 合适的酶合适的条件酶切质粒。
- 跑胶验证酶切效果，并切下合适大小的条带进行凝胶回收。
- 酶连，他使用寡核苷酸：质粒摩尔比为 3：1。
- 剩下的转化提质粒什么的。好像也没啥好记录的。想看的看原文
miRNA 体外筛选
直接给目的细胞转染的质粒，看看哪个有效，做的 qpcr 验证效果，怎么做的可以看看原文。
原文：Design of AAV Vectors for Delivery of RNAi，微信公众号后台回复 6，可获得文献包。
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