Design of AAV Vectors for Delivery of Large or Multiple Transgenes

上一篇是将敲减，这一部分讲用 AAV 递送多个转基因。AAV 不能有效包装超过 5 kb 的 DNA，所以需要些不一样的策略去克服这一困难。

• 利用促进单个 AAV 载体表达大型转基因的因素

1.拆分成几个质粒

1.1.Trans-splicing AAV vectors

• 载体 1：启动子 +5'端部分目的基因 + 剪接供体信号（splicing donor signal）
• 载体 2：剪接受体信号（splicing acceptor signal）+ 剩下的目的基因 +ployA 信号

不过这样的策略效率是一个问题[1]，有问题就会有优化，使用非同源的 AAV2 和 AAV5 ITR 以及工程单链 DNA 寡核苷酸等策略，引导了适当的头尾定向共聚。这些策略确实大大提高了反式拼接 AAV 载体的效率[2,3]。另外 pre-mRNA 和 mRNA 转录本的剪接效率和稳定性也有较大的影响[4]。

1.2 Overlapping AAV Vectors

• 载体 1：A+B+C
• 载体 2：C+D+E

利用 C 这段序列发生同源重组合并编码框。以下是这两种策略的成功应用。

1.3 Hybrid AAV Vectors

这种设计是结合了前面两种，拼接效率更高。

1.4 Triple AAV Vectors

三载体的设计可以递送长达 15kb 的基因，具体怎么搞，估计可能就是利用上述机制一个接着一个把基因串起来，以下是这些策略的成功应用。

2.单个载体递送超大基因

2.1 Fragmented Oversized AAVGene Delivery

其实这一段我没看太懂，不知道怎么实现的，就不翻译和总结了，感兴趣的看原文。

2.2 其他策略

• 改造外壳：缺失 VP2 可包装 6kb；使用人类 bocavirv -1 (HBoV1)的衣壳蛋白，可包装 5.5kb
• 使用蛋白酶体抑制剂：可增加蛋白表达
• 优化转录元件：还是增加表达

3.多基因递送

3.1 单个载体

用 T2A、P2A、IRES 隔开两个基因；双启动子

3.2 两个载体

可参考单个载体，要么就是一个载体一个基因

3.3 三个载体

载体一多，就可以搞点复杂的，比如把 CRISPR-cas9 所需原件感染至目的细胞，或者用点睡美人转座子啊其他什么的，也可以配合过表达和敲减同时增加疗效，反正就是各种组合，以下是一些案例。

原文：Design of AAV Vectors for Delivery of Large or Multiple Transgenes，欢迎关注微信公众号：一毛钱的本质

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[1]Duan, & D. (2001). Expanding aav packaging capacity with trans-splicing or overlapping vectors: a quantitative comparison. Molecular Therapy, 4(4), 383-391.

[2] Yan, Z. , Lei-Butters, D. C. M. , Zhang, Y. , Zak, R. , & Engelhardt, J. F. . (2007). Hybrid adeno-associated virus bearing nonhomologous inverted terminal repeats enhances dual-vector reconstruction of minigenes in vivo. Human Gene Therapy, 18(1), 81-87.

[3] Hirsch, M. L. , Storici, F. , Li, C. , Choi, V. W. , & Samulski, R. J. . (2009). Aav recombineering with single strand oligonucleotides. PLoS ONE, 4(11), e7705.

[4] Xu, Z. , Yue, Y. , Lai, Y. , Ye, C. , Qiu, J. , & Pintel, D. J. , et al. (2004). Trans-splicing adeno-associated viral vector-mediated gene therapy is limited by the accumulation of spliced mrna but not by dual vector coinfection efficiency. Human Gene Therapy, 15(9), 896-905.

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